оглавление

 

Методов приготовления постоянных окрашенных препаратов много, но наиболее часто применяются метод Гайденгайна и его модификации. Требуемые реактивы и оборудование: сулема, спирт этиловый, уксусная кислота, квасцы железо-аммиачные, гематоксилин, карболовая кислота, ксилол, канадский или пихтовый бальзам, большие часовые стекла, чашки Петри и бюксы.

 

Окраска препаратов по методу Гайденгайна

 

Мазки готовят из фекалий или из другого материала, например гноя из абсцесса, по тем же правилам, которые рекомендованы для приготовления свежих неокрашенных препаратов. Необходимо помнить, что если для приготовления окрашенных препаратов используется несвежий материал, то как бы точно не были выполнены все правила окраски, в итоге хороший препарат получить не удается, так как простейшие дегенерируют и их морфологические признаки меняются.
Мазок из исследуемого материала готовят на покровном стекле (можно готовить и на предметном стекле, но это менее удобно). Покровные стекла нужно брать тонкие, чтобы толщина стекла была не больше рабочего расстояния иммерсионного объектива, т. е. не более
0,15—0,17 мм. На край покровного стекла наносят небольшое количество фекалий, затем этим краем стекла проводят по другому покровному стеклу, которое держат за угол. В результате получается мазок более равномерный, чем при его изготовлении с помощью деревянной или стеклянной палочки.
С целью фиксации препарата стекло намазанной стороной вниз бросают на поверхность фиксатора Шаудинна, налитого в большое часовое стекло. Фиксатор готовят непосредственно перед употреблением, а его составные части хранят в лаборатории отдельно. Состав фиксатора Шаудинна следующий: насыщенный раствор сулемы — 6 мл, спирт 96° — 3 мл, ледяная уксусная кислота — 0,5 мл.

Для получения насыщенного раствора сулемы 10 г ее добавляют к 100 мл дистиллированной воды и нагревают до кипения. В горячей воде сулема полностью растворяется, в остывшем растворе на дно выпадают красивые острые кристаллы. Надосадочная жидкость представляет собой насыщенный раствор сулемы, который может храниться неограниченно долгое время.
Фиксировать можно как в подогретом до 40—50°С фиксаторе, так и в неподогретом. Подогретый фиксатор рекомендуется при наличии в материале вегетативных стадий простейших. Мазок в жидкости Шаудинна должен находиться 15—20 мин. После этого пинцетом с эбонитовыми концами осторожно переворачивают стекло мазком вверх (в таком положении мазок должен находиться во время всех последующих манипуляций, за исключением самой последней) и переносят в бюкс с 70° спиртом на 5 мин. Затем препарат помещают на 5—10 мин в спирт той же крепости с добавленным к нему йодом в таком количестве, чтобы жидкость имела цвет хорошо заваренного чая. В заключение стекло вновь переносят в чистый 70° спирт. Если по каким-либо причинам дальнейшая обработка препарата не может быть произведена, он может сохраняться в 70° спирте в течение нескольких недель.
Как во время фиксации, так и во время всех последующих процедур нужно внимательно следить за тем, чтобы препарат вне жидкости находился минимальное время. Перекладывание из жидкости в жидкость нужно делать по возможности быстрее.
Следующей операцией является протравливание. Мазки извлекают из спирта, споласкивают в дистиллированной воде и переносят для протравы в 2—4% водный раствор железо-аммиачных квасцов на 18—24 ч.
Железо-аммиачные квасцы представляют собой крупные кристаллы слегка фиолетового цвета. Если квасцы сохраняются в плохо закупоренных склянках, на поверхности кристаллов появляется желто-белый налет. Такие побелевшие квасцы не годны для работы. Их необходимо вымыть. Для этого кристаллы заливают дистиллированной водой и встряхивают. Мутную жидкость сливают и, если на кристаллах еще остался налет, снова наливают чистой воды и встряхивают. Отмытые кристаллы просушивают на фильтровальной бумаге и сохраняют в хорошо закупоренной посуде.

Раствор квасцов готовят перед употреблением. Он должен быть желтого цвета, прозрачный. При наличии осадка раствор нужно профильтровать через бумажный фильтр. При текущей работе в лабораторий, когда ежедневно требуется раствор квасцов, можно на несколько дней приготовить 20% раствор, из которого затем по мере надобности готовят рабочее разведение.
Окрашивание производят гематоксилином. После протравливания препарат споласкивают дистиллированной водой и помещают в раствор красителя на 18— 24 ч. Мазки сразу чернеют.
Раствор гематоксилина готовят следующим образом. Сухой гематоксилин, представляющий собой порошок из мелких желтоватых кристалликов (покрасневшие кристаллы не годятся для употребления), разводят абсолютным или 96° спиртом из расчета 1 г гематоксилина на 10 мл спирта. Этот раствор должен быть приготовлен заранее (за несколько недель до начала работы с ним и чем раньше, тем лучше). Из полученного 10% спиртового раствора готовят 0,5—1% водный раствор, для чего 5 или 10 мл спиртового раствора смешивают с 95 или 90 мл дистиллированной воды. Водный раствор гематоксилина должен «созреть» при комнатной температуре в течение 10—14 дней или в термостате при 37°С в течение 2—3 дней.
Раствор гематоксилина можно использовать повторно для нескольких партий препаратов. Критерием годности красителя является следующее: краска считается хорошей, если несколько капель, прибавленные к водопроводной воде, окрашивают ее сразу в фиолетовый цвет. Если же после прибавления краски появляется коричневый цвет, она непригодна для окрашивания препаратов.
Следующий этап — дифференцирование мазков. Препарат споласкивают дистиллированной водой и переносят в водопроводную воду, где мазки из интенсивно черных должны превратиться в сине-черные. Если поместить такой мазок под микроскоп, то становится ясно, что он сильно перекрашен, и рассмотреть строение простейших не представляется возможным. Для того чтобы выявилось строение простейших, главным образом структура ядер, находящихся в глубине перекрашенной цитоплазмы, нужно убрать излишек краски, т. е. обесцветить, или дифференцировать препарат. Обесцвечивание достигается помещением препаратов в водный раствор железо-аммиачных квасцов.

Скорость обесцвечивания зависит от концентрации раствора квасцов. Чем она выше, тем быстрее наступает обесцвечивание, но слишком Энергичная дифференцировка может сделать препарат непригодным для микроскопирования. Для того чтобы обесцвечивание мазка не наступало слишком быстро, берут слабый — 0,5 или 1% раствор квасцов. В тех случаях, когда еще нет навыка определять на глаз степень обесцвеченности, нужно дифференцирование вести под контролем микроскопа.
Прокрашенный и промытый в воде мазок помещают в раствор квасцов следующим образом. Мазок (вниз намазанной стороной) кладут на мостик, представляющий собой предметное стекло, к которому приклеены два кусочка предметного стекла. Под мазок при помощи пипетки наливают раствор квасцов, замечают время и мостик с препаратом помещают под микроскоп. Находят при малом увеличении образование, похожее по величине и форме на амебу или цисту, переводят на большое увеличение и наблюдают.
По мере просветления мазка в наблюдаемом совершенно черном круглом образовании, если оно окажется амебой, начинает постепенно проявляться ядро. Когда строение амебы станет хорошо видно (вновь замечают время), препарат споласкивают в дистиллированной воде, а затем помещают в водопроводную. Оставшиеся препараты (а от одного больного готовят не менее
4   препаратов) дифференцируют все вместе в растворе квасцов в течение того промежутка времени, которое понадобилось для первого пробного препарата.
После дифференцирования мазки должны быть хорошо промыты водой (лучше проточной) в течение 20— 30 мин. Если это требование не соблюдено, оставшиеся следы квасцов будут продолжать свое действие и мазок постепенно «выцветает». 
Обезвоживание и заключение в бальзам является заключительной стадией приготовления постоянного препарата. Перед заключением в бальзам мазок должен быть хорошо обезвожен и просветлен. Достигается это путем проведения через батарею спиртов восходящей крепости, карбол-ксилола и ксилола. Батарея состоит из 6 бюксов, в которые наливают 70°, 96° и еще раз 96° спирты, карбол-ксилол и дважды ксилол. В спиртах мазок должен находиться по 5—10 мин, а в остальных бюксах — по 2—3 мин. При перекладывании мазка во время обезвоживания и просветления необходимо перед помещением мазка в следующий бюкс прикасаться краем стекла к фильтровальной бумаге, чтобы оттянуть излишек жидкости и не нарушать концентраций спирта или ксилола в каждом следующем бюксе.

Из последнего бюкса с ксилолом препарат мазком вниз помещают на каплю бальзама, нанесенную на предметное стекло. Бальзам распределяется равномерно между стеклами. Нужно следить, чтобы под покровным стеклом не было пузырей. Если же пузырьки образовались, необходимо слегка надавить на покровное стекло.

 

Модификация окраски гематоксилином по Фаусту

Модифицированная методика окраски по Фаусту складывается из следующих операций:
1. Мазки фиксируют в подогретой до 60°С жидкости Шаудинна в течение 2 мин.
2. Проводят мазки через три порции 70° спирта и затем через 50° спирт по 2 мин в каждом.
3. Промывают в течение 2 мин дистиллированной водой.
4. Помещают для протравы в 2% водный раствор железо-аммиачных квасцов, подогретый до 40°С, на 2 мин.
5. Промывают в течение 3 мин дистиллированной водой.
6. Мазки помещают в 0,5% водный раствор гематоксилина на 2 мин.
7. Промывают в течение 2 мин в дистиллированной
воде.
8. Дифференцируют препараты в холодном 1% растворе железо-аммиачных квасцов в течение 2—5 мин.
9. Споласкивают мазки в дистиллированной воде и затем промывают в водопроводной воде в течение 10— 15 мин.
10. Проводят через спирты 70°, 80°, 90° и абсолютный, в каждом из них выдерживая по 2 мин.
11. Просветляют в ксилоле в течение 1—2 мин.
12. Препарат заключают в канадский или пихтовый бальзам.
Препараты, окрашенные по методу Фауста, получаются достаточно хорошими. Эта модификация имеет преимущество перед классическим методом окраски по Гайденгайну в том, что на приготовление препарата по методу Фауста требуется около 60 мин, в то время как ПО методу Гайденгайна — двое суток.

 

Показания к изготовлению постоянных препаратов

Исследование постоянных окрашенных препаратов должно производиться в тех случаях, когда по свежим препаратам (неокрашенным и окрашенным йодом) не удается точно установить вид простейших. В сложной картине мазка из фекалий можно точно разобраться лишь на окрашенном препарате. Особенно трудны для исследования фекалии при воспалительных реакциях в кишечнике. Наличие клеток воспалительного экссудата в отделяемом кишечника всегда свидетельствует о патологических изменениях в его стенке. Нарушение целости слизистой оболочки толстого кишечника может быть обусловлено разнообразными причинами, наиболее часто это наблюдается при бактериальной дизентерии, амебиазе и балантидиазе.
Значительные затруднения возникают при необходимости дифференцировать бактериальную дизентерию и амебиаз на основании микроскопического исследования фекалий.
Наличие макрофагов и лейкоцитов характерно для обоих заболеваний. Особенно трудны для распознавания макрофаги, которые в свежем неокрашенном препарате имеют черты сходства с вегетативными стадиями дизентерийной амебы. Из такого материала должны быть обязательно приготовлены окрашенные препараты, на которых отчетливо выявляется строение ядра, что дает возможность точно отличить макрофаги от амеб.
Очень большим достоинством постоянных препаратов является то, что они могут быть в случае необходимости повторно исследованы. Микроскопируют окрашенные мазки с иммерсионной системой, при хорошем освещении.

 

оглавление