оглавление

 

Для повышения квалификации в области лабораторной диагностики гельминтозов требуется изучение морфологии гельминтов. Микроскопистов обучают на свежих и постоянных препаратах. Свежие препараты имеют преимущество, заключающееся в легкости изготовления препарата, но они имеют и значительный недостаток: период их исследования ограничен. Кроме того, в свежих препаратах не всегда достаточно отчетливо выявляются некоторые морфологические детали.
Постоянные микроскопические препараты готовят из целых гельминтов небольшого размера, из отдельных частей крупных гельминтов и из яиц гельминтов. Постоянные препараты бывают окрашенные и неокрашенные, с предварительной фиксацией и нефиксированные.

 

Постоянные препараты неокрашенные, без предварительной фиксации

 

Такие препараты готовят из зрелых члеников крупных цестод для изучения строения матки, заполненной яйцами.
Техника изготовления препаратов заключается в следующем. Конечная часть стробилы бычьего и свиного цепней или широкого лентеца помещается в холодную воду на 1—2 сут. Воду необходимо менять 4—5 раз. За этот период времени спастически сокращенные членики расправляются, происходит некоторая мацерация, они становятся мягкими и легко поддаются дальнейшей обработке. Затем стробилу разрезают ножницами по границе соединения члеников. У бычьего и свиного цепней членики отделяют по одному, а у широкого лентеца — по 3—4 членика ’. Препаровальной иглой, не повреждая.

При изготовлении препаратов из зрелых члеников свиного цепня необходимо соблюдать осторожность, тщательно следить, чтобы онкосферы не попали на руки. После манипуляций с этими члениками следует хорошо вымыть руки и простерилизовать всю посуду и инструменты.
ткань членика, их переносят на предметное стекло, укладывают вдоль стекла, расправляют, проверяют, нет ли пузырьков воздуха под члеником. Для удаления пузырей надо провести по членику иглой, держа ее параллельно стеклу и слегка надавливая на членик. Излишки воды на стекле вокруг членика удаляют фильтровальной бумагой.
Высушивание члеников происходит при комнатной температуре за 18—24 ч. Когда членики высохнут, необходимо осторожно обтереть стекло, если на нем остались следы высохшей жидкости. На сухих члениках должно быть отчетливо видно строение матки. С целью сохранения препаратов их заделывают в бальзам. Для этого на каждый членик, присохший к стеклу, наносят жидкий бальзам (канадский или пихтовый) и накладывают покровное стекло, размер которого должен соответствовать размеру препарата. Бальзам высыхает медленно, в течение 10—15 дней.

 

Постоянные препараты фиксированные, неокрашенные

 

Эти препараты готовят из сколексов крупных цестод, из трихинеллезного мяса. Фиксацию сколексов крупных цестод (бычьего или свиного цепней) производят одновременно с легким прессованием.
Головки выделенных цестод отрезают от стробилы вместе с небольшим участком шейки. Для приготовления препаратов могут быть использованы вывернутые финны, в этом случае капсулу финны отрезают. Сколексы по 5—7 штук укладывают на предметное стекло в один ряд, накрывают другим предметным стеклом, слегка придавливают и завязывают ниткой.
Стекло со сколексами погружают в 70° спирт на 12—24 ч. За этот период происходит фиксация и сколексы становятся плоскими, хорошо бывают видны присоски, а также крючья на сколексе свиного цепня. Если фиксацию в спирте производить без прессования, то головки сжимаются, приобретают округлую форму и после дальнейшей обработки не расправляются. На таких препаратах плохо бывают видны присоски, крючья на хоботке свиного цепня располагаются близко друг к другу.

По этой же методике готовят препараты из трихинеллезного мяса. Кусочки мышечной ткани, зараженной личинками трихинелл, препаровальными иглами расщепляют вдоль волокон на мелкие частицы. Кусочки мышц укладывают на предметное стекло, закрывают другим предметным стеклом и слегка придавливают, а затем оба стекла связывают ниткой и погружают в 70“ спирт на 12—24 ч. Если фиксацию мышц провести без прессования между стеклами, ткань в спирте сжимается и в препаратах будут плохо заметны личинки трихинелл.
По окончании фиксации стекла со сколексами и кусочками трихинеллезного мяса извлекают из спирта, развязывают нитки и с поверхности стекол осторожно препаровальной иглой снимают спрессованные сколексы и кусочки мышечной ткани в 70 спирт. Обезвоживание производят в спиртах восходящей крепости, помещая материал из 70° в 80°, затем в 96° и еще раз в 96° спирт, выдерживая в каждом из них по 5 мин. Перекладывание из бюкса в бюкс надо производить осторожно и брать препаровальной иглой или маленьким пинцетом за самый край кусочка ткани, а сколексы захватывать за свободный конец шейки.
После обезвоживания в спиртах препараты должны быть просветлены. С этой целью препараты последовательно проводят через карбол-ксилол, ксилол и еще раз ксилол (состав карбол-ксилола: 1 часть фенола и 3 части ксилола). В указанных жидкостях препараты должны находиться не более одной минуты в каждой. Затем препараты заключают в бальзам, для чего их переносят на предметное стекло в нанесенную на него каплю бальзама и накрывают покровным стеклом. Закрывать стеклом следует осторожно, подводя его к капле бальзама под углом во избежание образования пузырьков воздуха. Готовый препарат высыхает в течение 10—15 дней.

 

Постоянные препараты, окрашенные без предварительной фиксации

 

Такие препараты готовят из гермафродитных члеников крупных цестод. Предварительно готовят молочнокислый кармин, для чего 0,1—0,3 г кармина растворяют в 100 мл 50% молочной кислоты.

Техника приготовления препаратов следующая. Часть стробилы выделенного гельминта, состоящую из гермафродитных члеников, выдерживают в водопроводной воде в течение 1—3 дней, затем помещают в молочнокислый кармин на 4—6—12 ч. Срок нахождения в красителе зависит от величины объекта. Если стробила тонкая, то достаточно держать в краске 4—5 ч, если стробила толстая (например, у бычьего цепня), то окрашиваться она должна более продолжительное время.
После окрашивания стробила должна быть хорошо промыта, для чего сосуд с помещенной туда стробилой завязывают марлей и переносят под струю водопроводной воды. Марля в данном случае необходима для того, чтобы струя воды не смыла препарат. Промывать нужно не менее часа. По окончании промывания стробилу разрезают ножницами на отдельные кусочки по 2—3 членика в каждом, раскладывают на предметные стекла и оставляют для высыхания на 6—12 ч. Сухие членики заливают бальзамом и накрывают покровным стеклом.

 

Постоянные препараты фиксированные и окрашенные

Эти препараты готовят из мелких трематод или це- стод, а также из гермафродитных члеников крупных цестод.
Предварительно готовят краситель — солянокислый кармин. Для этого берут 5 г кармина, растирают в ступке с 5 мл соляной кислоты и 5 мл дистиллированной воды. Тщательно растертую смесь оставляют на час. Затем из ступки кармин переносят во флакон и добавляют 200 мл 90° спирта, смесь помещают на водяную баню до полного растворения кармина, примерно на 1 — 1,5 ч. За это время часть спирта испаряется, поэтому по окончании растворения кармина добавляют во флакон спирт той же крепости до первоначального объема. Солянокислый кармин сохраняют в хорошо закупоренном сосуде длительное время.
Техника фиксации и окраски препаратов следующая. Свежевыделенные трематоды или цестоды выдерживают в воде: мелкие объекты 3—4 ч, крупные —6—12 ч. Затем гельминты раскладывают на предметном стекле, накрывают его другим и перевязывают стекла ниткой. Препараты переносят в 70° спирт на 1—2 ч (мелкие объекты) или 6—12 ч (крупные объекты).
По окончании фиксации гельминты осторожно снимают со стекол и погружают в солянокислый кармин на срок от 30 мин до 1 ч в зависимости от величины объекта.
Извлеченные из солянокислого кармина гельминты окрашены в интенсивно красный цвет. Для удаления излишков краски и выявления деталей строения гельминты переносят в солянокислый спирт (на 100 мл 80° спирта добавляют 2—3 капли соляной кислоты) на 5—10 мин. После того как станут хорошо заметными семенники, яичники и другие детали строения, препараты переносят в чистый 80° спирт.
С целью дальнейшего обезвоживания исследуемые объекты переносят в 96° спирт, дважды меняя порции. В бюксах со спиртами гельминты должны находиться не менее 5—7 мин. После этого объекты проводятся через карбол-ксилол и дважды через ксилол.
В бюксах с ксилолом объекты должны находиться не более 1—2 мин. Перенесенный из спирта в бюкс с кар- бол-ксилолом, гельминт плавает на поверхности. Поэтому препаровальной иглой или пинцетом его нужно обязательно погрузить на дно бюкса. После проведения гельминта через ксилолы его переносят на предметное стекло, на котором нанесены 1—2 капли бальзама. Хорошо расправив препарат, сверху наносят еще 1—2 капли бальзама и осторожно закрывают покровным стеклом.

 


Приготовление постоянных препаратов, заключенных в глицерин-желатину


Такие препараты готовят из мелких нематод и трематод. Техника изготовления следующая. Свежевыделенные гельминты помещают в воду на 3—4 ч для промывания. После этого нематоды подвергают дальнейшей обработке, а трематоды, имеющие плоское тело, должны быть спрессованы и зафиксированы так же, как это указывалось в разделе приготовления фиксированных препаратов из трематод.
Промытые нематоды и расправленные трематоды последовательно проводят через смеси спирта разной крепости и глицерина. Указанные смеси должны быть приготовлены заранее и сохраняются в хорошо закупоренных флаконах.

Готовят их по следующей прописи:
1-я      смесь —20 мл 40° спирта и 2 мл глицерина
2-я                 » —20 » 50° » и 5 » »
3-я                 » —20 » 60° » и 6 » »
4-я                 » — 20 » 70° » и 10 » »
В каждой из указанных смесей гельминты выдерживают по 24 ч. Сосуд с последней смесью через 24 ч приоткрывают для того, чтобы спирт испарился. Когда количество жидкости в бюксе уменьшится на одну треть, гельминты оказываются почти в чистом глицерине, откуда их извлекают по одному экземпляру на предметное стекло. При помощи фильтровальной' бумаги или марли осторожно удаляют излишек глицерина.
На расправленный гельминт наносят расплавленную глицерин-желатину, осторожно накрывают покровным стеклом и слегка придавливают. Если глицерин-желатина выступила за пределы покровного стекла, ее удаляют после того, как она застынет. Излишки глицерин-желатины срезают бритвой или скальпелем, предметное стекло вытирают тряпочкой, смоченной теплой водой. Чтобы предотвратить высыхание препарата и сохранить его длительное время, края покровного стекла окантовывают жидким бальзамом.

 

Приготовление глицерин-желатины

Заливают 2 г сухой желатины 12 мл дистиллированной воды и оставляют на несколько часов до тех пор, пока желатина разбухнет. Затем сосуд с разбухшей желатиной помещают на водяную баню. Необходимо все время помешивать стеклянной палочкой. После полного растворения желатины к ней добавляют 7 мл чистого глицерина. Для предупреждения развития плесени к расплавленной глицерин-желатине добавляют несколько крупинок фенола. Затем ее процеживают через два слоя марли. Сохраняют глицерин-желатину в закупоренном сосуде. Перед употреблением смесь расплавляют на водяной бане.

 

Приготовление постоянных препаратов из яиц гельминтов


Для приготовления постоянных препаратов свежевыделенные яйца не пригодны. Они должны быть предварительно выдержаны в глицерине. Взвесь яиц в глицерине должна буть концентрированной, чтобы в небольшой капле было достаточное количество яиц.
Яйца гельминтов получают двумя способами: а) выделяют из матки взрослых гельминтов и б) собирают из фекалий, применяя методы обогащения.
Яйца из матки взрослых гельминтов выделяют с целый получения яиц трематод, онкосфер бычьего цепня, яиц широкого лентеца и остриц. Взрослые трематоды или острицы, зрелые членики бычьего цепня или широкого лентеца помещают в большое часовое стекло. Препаровальными иглами разрывают область матки. Из пипетки на разорванную часть гельминта наносят несколько капель физиологического раствора для смывания яиц. Жидкость собирается на дне стекла. Обрывки гельминта удаляют.
После оседания яиц на дно часового стекла, что происходит в течение 15—20 мин, поверхностный слой жидкости удаляют, а к осадку добавляют 50% водный раствор глицерина, в котором яйца до приготовления препаратов выдерживают не менее 7—10 дней. Сохранение их в глицерине более длительное время (месяцы и даже год) не отражается на структуре яиц.
Яйца власоглава, крысиного цепня, шистосом, неоплодотворенные яйца аскарид собирают из фекалий лиц, зараженных тем или иным видом гельминта, применяя методы обогащения (сбор яиц из пленки по методу Фюллеборна или Калантарян). Полученные таким образом яйца отмывают от соли и сохраняют в 50% растворе глицерина. Постоянные препараты нельзя приготовить из яиц анкилостомид, трихостронгилид, карликового цепня, оплодотворенных яиц аскариды.
С целью изготовления постоянного препарата на предметное стекло при помощи заостренной спички наносят каплю взвеси яиц. Для заключения в глицерин-желатину можно воспользоваться одним из двух способов.
1.   На каплю взвеси яиц, нанесенную на предметное стекло, опускают каплю расплавленной глицерин-желатины и накрывают покровным стеклом. Жидкость под стеклом должна распределиться равномерно.
2.   На покровное стекло, которое держат за один уголок, стеклянной палочкой наносят равномерный слой расплавленной глицерин-желатины. Затем это стекло под углом подводят к капле взвеси яиц, находящейся на предметном стекле, и осторожно опускают. Яйца и глицерин-желатина, как и в предыдущем случае, должны равномерно распределиться между стеклами.
Необходимо помнить, что глицерин-желатина быстро застывает, поэтому все манипуляции с ней надо совершать по возможности быстро.
Основные дефекты, которые могут возникнуть в процессе изготовления препаратов, следующие.
A.  Глицерин-желатина не полностью заняла пространство между стеклами или образовались пузырьки воздуха. Это может произойти из-за малого количества взятой глицерин-желатины. Устранить этот недостаток нельзя, надо сделать новый препарат.
Б. Глицерин-желатина застыла и не растеклась между стеклами. В таком случае необходимо стекло немного подогреть до расплавления желатины, после чего она растечется между стеклами.
B.  На каплю взвеси яиц нанесено слишком много глицерин-желатины и она вышла за пределы покровного стекла.
Препарат надо проверить под микроскопом, и если выступившая за пределы стекла глицерин-желатина увлекла яйца гельминтов и под покровным стеклом их не осталось, то препарат надо сделать снова. Если же под покровным стеклом осталось достаточное количество яиц, то после того, как желатина застынет, удаляют ее излишки тем же способом, как это было описано в предыдущем разделе.
Правильно приготовленный препарат должен иметь следующий вид: покровное стекло плотно прилегает к предметному, глицерин-желатина заполняет все пространство между стеклами и не выступает за пределы покровного стекла. Для предотвращения высыхания препарата его окантовывают жидким бальзамом. Надпись на препарате с обозначением вида гельминта или яиц делают чернилами по стеклу.

 

Приготовление чернил по стеклу

Растворяют 1 г основного фуксина в 15 мл 96° спирта. Для лучшего растворения указанная смесь должна постоять в закупоренном сосуде сутки. В другом флаконе растворяют 2 г таннина светлого цвета в 15 мл дистиллированной воды. Растворять таннин следует при легком подогревании. Когда таннин полностью растворится, раствор надо профильтровать через фильтровальную бумагу. Остывший раствор таннина сливают с раствором фуксина и чернила готовы. Хранят их в хорошо закупоренном сосуде. Надписи удобно делать тонким пером.

 

 

оглавление