оглавление

 

Протозойные инфекции сопровождаются выработкой иммунитета и появлением в крови антител, на обнаружении которых основаны серологические методы диагностики ряда протозоозов. С указанной целью применяют реакцию связывания комплемента (токсоплазмоз), реакцию гемагглютинации (трихомоноз, токсоплазмоз), реакцию флуоресцирующих антител (малярия, пневмо- цистоз, внекишечный амебиаз, трихомоноз).
Приводим краткое описание методики реакции иммунофлуоресценции с целью диагностики пневмоцистоза (В. А. Рябцева и др., 1974). Сыворотки больных исследуют в разведениях от 1 : 5 до 1 : 50. Реакцию ставят по схеме, антиген (пневмоцисты) + исследуемая сыворотка + люминесцирующая сыворотка против глобулинов человека. В качестве антигена используют мазки-отпечатки легкого от больного, умершего от пневмоцист- ной пневмонии. Легкое сохранялось в течение 10 дней при температуре—8—10°С. После оттаивания из ткани легкого приготовляли мазки-отпечатки по общепринятой методике, высушивали на воздухе, фиксировали 96“ этиловым спиртом в течение 20 мин и сохраняли при —6°С.
На препараты, содержащие антиген (т. е. мазки-отпечатки легкого), наносят на 10—20 мин при комнатной температуре капли различных разведений исследуемой сыворотки; препараты помещают во влажную камеру для предохранения сыворотки от высыхания, после чего дважды промывают в 0,15 М растворе хлористого натрия (pH 7,2—7,4) по 10 мин для удаления несвязавшей- ся сыворотки. После подсушивания на воздухе на препараты на 10—20 мин наносят капли люминесцирующей сыворотки против, глобулинов человека (сыворотку готовят в производственном отделе Института эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф. Гамалеи АМН СССР). После тщательного промывания мазков в физиологическом растворе и высушивания на воздухе мазки просматривают в люминесцентном микроскопе с иммерсионной системой при увеличении 7 X 90.
При оценке результата учитывают специфическое свечение цист паразита, так как свечение отдельных особей пневмоцисты трудно отличить от возможных в препарате артефактов. При интенсивном свечении оболочки цисты результат реакции оценивают в 3 или 4 креста. Равномерное бледно-зеленое или серо-зеленое свечение всей цисты без четких границ считают неспецифическим.

С целью серологической диагностики моче-полового трихомоноза могут быть использованы реакции иммунофлуоресценции и пассивной гемагглютинации, методику постановки крторых и приготовления антигена усовершенствовал П. П. Петров (1969). Серологические методы особо ценными могут оказаться для диагностики трихомоноза у мужчин, у которых инфекция .часто протекает бессимптомно и возбудитель не обнаруживается другими методами, а также в случаях хронического течения инфекции у женщин. Большая длительность выявления антител с помощью реакции иммунофлуоресценции делает ее перспективной для ретроспективного диагноза трихомоноза, что важно с эпидемиологической и клинической точек зрения.
Реакция связывания комплемента широко используется в диагностике токсоплазмоза. Сущность этой реакции заключается в следующем (рис. 82). Антиген, в данном случае токсоплазменный, соединяется со специфическими антителами при его добавлении к сыворотке крови больного токсоплазмозом.
Антиген — это высушенный под вакуумом перитонеальный экссудат белых мышей, зараженных токсоплазмами. Готовится антиген в производственных условиях и поступает в ампулах.
Если к смеси «сыворотка + антиген» добавить комплемент (комплемент — это сыворотка крови морской свинки, также поступающая в ампулах в высушенном состоянии), то образуется единый комплекс «антиген + антитело + комплемент». Это первый этап реакции, проходящий в течение 18 час при выдерживании смеси в холодильнике. Затем добавляют предварительно выдержанную в термостате в течение 30 мин смесь из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки. Последняя представляет собой сыворотку кроликов, иммунизированных эритроцитами барана, и также поступает в готовом виде, в ампулах.
Гемолитическая сыворотка вызывает гемолиз эритроцитов барана только в присутствии комплемента. Если последний связан комплексом «антиген + антитело», то гемолитическая сыворотка не может оказать свое действие, и эритроциты не гемолизируются, т. е. не растворяются и оседают на дно. Надосадочная жидкость остается прозрачной и бесцветной. Такой результат реакции считается положительным, т. е. свидетельствующим о том, что в сыворотке содержались специфические, в данном случае для токсоплазмоза, антитела.

Если в сыворотке больного этих антител нет, то комплемент при смешивании с антигеном не соединится с ним и, наоборот, присоединится к комплексу «эритроциты барана + гемолитическая сыворотка» (этот комплекс проще называется гемолитической смесью). В результате наступает гемолиз эритроцитов барана. Жидкость в пробирке становится прозрачной и ярко-красной, осадок отсутствует. Результат реакции отрицателен.
Подробно техника постановки реакции связывания комплемента при токсоплазмозе изложена ниже.

 

Техника постановки реакции связывания комплемента на токсоплазмоз

Реакция связывания комплемента является достаточно сложным лабораторным исследованием, в проведении которого можно выделить два основных этапа: 1) предварительная подготовка; 2) основная реакция (главный опыт). Каждый из указанных этапов состоит в свою очередь из целого ряда операций.
В периоде предварительной подготовки проводят следующее.
1.   Приготовление физиологического раствора: к 1 л дистиллированной воды добавляют 8,5 г хлорида натрия, смесь нагревают до кипения, остужают, закрывают стерильной пробкой. На сосуде указывают дату приготовления раствора.
2.   Приготовление консерванта для эритроцитов: в колбочку к 100 мл физиологического раствора добавляют 6 г глюкозы и 4,5 г борной кислоты, кипятят на водяной бане по 20 мин 3 дня подряд. Готовый консервант хранят в холодильнике.
3.   Получают эритроциты барана. Для этого берут кровь из яремной вены барана, возраст которого должен быть в пределах 1—4 лет. Кровь можно брать в дозе 100—200 мл не чаще 1 раза в 2 нед. Через каждые Змее делают трехнедельный перерыв, а через П/г года барана заменяют другим.
Полученную кровь собирают в стерильную банку со стеклянными бусами, активно встряхивают в течение
5   мин для предупреждения свертывания и выделения фибрина. Затем фильтруют через два слоя марли.

К дефибринированной крови из расчета на каждые 100 мл ее добавляют 15 мл консерванта и ставят в холодильник. Срок хранения эритроцитов достигает месяца. Через 3—4 нед хранения эритроциты, сохранявшие до этого красный цвет, начинают чернеть — это указывает на то, что они начали портиться. В случае, если подобные эритроциты после пробного трех — четырехкратного центрифугирования с физиологическим раствором все еще дают красную надосадочную жидкость, то необходимо получить свежую кровь барана.
4.   Титрование гемолитической сыворотки необходимо при получении новой серии, а также при длительном хранении ее. Эту процедуру достаточно проводить 1 раз в 6 мес.
Титрование проводят следующим образом. Предварительно готовят основное разведение сыворотки 1 : 100, для чего 0,1 мл ее добавляют к 9,9 мл физиологического раствора. Затем берут 10 пробирок, нумеруют их и последовательно наливают физиологический раствор в следующем количестве, начиная с 1-й пробирки: 0,5; 0,8; 1,1; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,8; 1,9; 2,1 мл. После этого во все пробирки добавляют по 0,1 мл гемолитической сыворотки (1 :100), получая ряд последовательных разведений: 1 :600; 1 :900; 1 :1200; 1 :1500; 1 :1600; 1 :1700; 1 :1800; 1 : 1900; 1 :2000; 1 :2200. Отмывают эритроциты, для чего
2—3 мл взвеси их из консерванта переносят в центрифужную пробирку, добавляют физиологический раствор на 2/з ее объема, центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость отсасывают пипеткой, в пробирку добавляют новую порцию физиологического раствора и повторно центрифугируют. Процедуру повторяют 2—3 раза до получения бесцветной надосадочной жидкости.
Из отмытых эритроцитов готовят 3% взвесь. Для титрования гемолитической сыворотки достаточно 5 мл взвеси. Следовательно, если на 100 мл физиологического раствора необходимо взять 3 мл отмытых эритроцитов, то на 5 мл раствора—0,15 мл.
Разводят сухой комплемент. Содержимое ампулы растворяют в 1 мл физиологического раствора (согласно указанию на этикетке), а затем 0,1 мл полученного жидкого комплемента добавляют к 0,9 мл физиологического раствора, получая разведение 1: 10.

Таблица 8
Схема постановки контроля при титровании гемолитической сыворотки


Ингредиенты, мл

гемолити-
ческой
сыворотки

Контроли
комплемен
та

эритроци
тов

1. Гемолитическая сыворотка в титре

 

 

 

1 : 600

0,2

2. Взвесь эритроцитов (3%)

0,2

0,2

0,2

3. Комплемент в разведении 1 : 10

0,2

4. Физиологический раствор

0,6

0,6

0,8

 

В 10 чистых пробирок последовательно переносят пипеткой по 0,2 мл каждого разведения гемолитической сыворотки, начиная с наибольшего, в данном случае с 1 :2200. Затем в каждую пробирку добавляют по 0,2 мл 3% взвеси эритроцитов, по 0,2 мл комрдемедта в разведении 1 : 10 и по 0,4 мл физиологического раствора. Кроме того, в 3 пробирках ставят контроля (табл. 8).
После добавления всех ингредиентов пробирки помещают в термостат при 37°С на 1 ч. Результат учитывают сразу после того, как пробирки вынуты из термостата. Во всех контролях должна быть полная задержка гемолиза (эритроциты в осадке, жидкость бесцветная). Затем оценивают итоги титрования. В пробирках с разведениями сыворотки от 1 : 600 до 1 : 1800 наступил полный гемолиз (осадка нет, жидкость красная). В титре 1: 1900 и выше наблюдается задержка гемолиза. Следовательно, титром данной гемолитической сыворотки будет считаться то ее максимальное разведение, которое в данном объеме вызвало полный гемолиз эритроцитов в таком же объеме в присутствии комплемента, т. е. 1 : 1800. Для постановки реакции связывания комплемента может быть использована гемолитическая сыворотка с титром не ниже 1 : 1200.
В день постановки основной реакции (главного опыта) работа проводится в следующем порядке.
1.   Исследуемые сыворотки в объеме 0,2 мл смешивают с 0,8 мл физиологического раствора, получая исходное разведение 1 :5; инактивируют на водяной бане при 56°С в течение 30 мин для разрушения естественного комплемента.

Рассчитывают, какое количество пробирок будет занято в реакции. Для каждой сыворотки готовят не менее 4 разведений (от 1 : 5 до 1 :40) с учетом явления так называемой прозоны, когда в небольших разведениях реакция остается отрицательной, а положительные результаты начинают получаться в титрах 1 : 20 или 1 :40. Если в опыт берется 10 испытуемых сывороток, то на все их разведения потребуется 40 пробирок, еще 10 нужно для постановки контроля с каждой сывороткой и 3 пробирки для контроля антигена — всего 53. Кроме того, для титрования комплемента (см. ниже) требуется еще 10 пробирок. Всего, таким образом, потребуется 63 пробирки или округленно — 70.
Число пробирок необходимо знать для расчета количества гемолитической системы, которая должна готовиться одновременно для титрования комплемента и основной реакции. При постановке реакции связывания комплемента в объеме 1 мл на каждую пробирку необходимо 0,4 мл гемолитической системы, на 10 пробирок — 4 мл, на 20 пробирок —8 мл и т. д. Учитывая расход жидкости на разлив, число пробирок при расчете всегда нужно брать с некоторым избытком.
Выше в качестве примера был приведен расчет 70 пробирок. Следовательно, понадобится 28 мл гемолитической системы, для приготовления которой необходимо взять равное количество 3% взвеси эритроцитов и гемолитической сыворотки, разведенной в тройном титре, т. е. по 14 мл каждого ингредиента.
2.   Отмывают эритроциты. Если в 100 мл 3% взвеси содержится 3 мл эритроцитов, то в 14 мл взвеси — соответственно 0,42 мл. В колбочку наливают 13,58 мл физиологического раствора и 0,42 мл отмытых эритроцитов.
3.   Разводят гемолитическую сыворотку по тройному титру. С этой целью уменьшают в 3 раза значение титра, указанного на этикетке ампулы или полученного при титровании. Так, если титр сыворотки 1 : 1800, то необходимо ее разводить из расчета 1 :600. Отсюда к 59,9 мл физиологического раствора добавляют 0,1 мл цельной гемолитической сыворотки (при другом титре, например 1 :1500, берут 49,9 мл физиологического раствора и 0,1 сыворотки, получая титр 1 :500).

4.         Приготовление гемолитической системы. Для титрования комплемента (10 пробирок) понадобится с учетом некоторого избытка 5 мл системы. В пробирку вносят 2,5 мл взеси эритроцитов и добавляют столько же гемолитической сыворотки (1:600). Смесь помещают в термостат при 37°С на 30 мин. Остальную часть взвеси эритроцитов и разведенной гемолитической сыворотки оставляют в холодильнике на следующий день (не сливая их).
5.   Титрование комплемента. Пока гемолитическая система находится в термостате, разводят комплемент. Для этого в ампулу вносят 1 мл физиологического раствора, после растворения сухого вещества пипеткой набирают 0,1 мл полученного жидкого комплемента и добавляют к 0,9 мл физиологического раствора, получая разведение 1 : 10.

 

Таблица 9
Пример титрования комплемента

 

 

 

Номера пробирок

 

 

Конт
роль
гемоли
тиче
ской
системы

Конт

Ингредиенты, мл

1

2

3

4

5

6

7

8

роль
комп
лемен
та

1. Комплемент (1 : 10)

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

 

0,2

2. Физиологический раствор

0,38

0,37

0,36

0,35

0,34

0,33

0,32

0,31

0,6

0,4

3. Антиген

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

4. Гемолитическая система

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

термостат при 37°С на 30 мин


Результат

+ + + + | + + -'t

+ +

III

+ + + +

 

 

задержка

 

ПОЛНЫЙ

задержка

полный

 

гемолиза

 

гемолиз

гемолиза

гемолиз

 

В 8 пробирок микропипеткой вносят разведенный (1 : 10) комплемент в дозах от 0,02 до 0,09 мл (табл. 9), затем физиологический раствор до общего объема — 0,6 мл. Согласно инструкции, рекомендуется еще добавить во все пробирки по 0,2 мл антигена, разведенного в соответствии с указанием на этикетке ампулы. Титрование комплемента в присутствии антигена проводят обычно при получении новой серии антигена. В этом случае физиологический раствор доливают к разведениям комплемента до объема 0,4 мл.

Гемолитическую систему разливают во все пробирки по 0,4 мл. Результат титрования комплемента учитывают через 30 мин инкубирования в термостате. За единицу комплемента принимают то наименьшее его количество, которое вызывает полный гемолиз, в данном примере— 0,05. За полную единицу принимается значение второй пробирки с полным гемолизом, в данном случае— 0,06. Рабочей дозой комплемента называется его количество для реакции в одной пробирке, превышающее на 30% полную единицу, в данном случае — 0,08.
6.   Рассчитывают количество комплемента, необходимое для основной реакции (главного опыта). С этой целью рабочую дозу умножают на число пробирок, взятых в опыт. Так, на 60 пробирок (округленно) потребуется 4,8 мл разведенного (1 : 10) комплемента, или 0,48 мл цельного. Так как рабочая доза содержится в 0,2 мл раствора, то на 60 пробирок общий объем раствора должен быть равным 12 мл (60×0,2) и содержать 0,48 мл цельного комплемента и 11,52 мл физиологического раствора.
С целью упрощения расчетов перед каждой постановкой реакции полезно заранее составить схему добавления компонентов в зависимости от рабочей дозы комплемента (табл. 10).

Таблица 10
Расчет количества комплемента (мл) в зависимости от его рабочей дозы и числа пробирок, взятых в опыт (объем 1 мл)

 

 

Рабочая доза комплемента

 

 

0,08

0,09

0,1

пробирок

физиоло

 

физиоло

цельный

физиоло

цельный

 

гический
раствор

комплемент

гический
раствор

комплемент

гический
раствор

комплемент

10

1,92

0,08

1,91

0,09

1,9

0,1

20

3,84

0,16

3,82

0,18

3,8

0,2

30

5,76

0,24

5,73

0,27

5,7

0,3

40

7,68

0,32

7,64

0,36

7,6

0,4

50

9,6

0,4

9,55

0,45

9,5

0,5

60

11,52

0,48

11,46

0,54

11,4

0,6

70

13,44

0,56

13,37

0,63

13,3

0,7

80

15,36

0,64

15,28

0,72

15,2

0,8

90

17,28

0,72

17,19

0,81

17,1

0,9

100
и т. д.

19,2

0,8

19,1

0,9

19,0

1,0

 

7.         Постановка основной реакции (главного опыта). Исследуемые сыворотки разводят в титрах от 1 :5 до 1 :40. Общий объем реакции в одной пробирке равен 1 мл или 1,25 мл (в последнем случае необходимо пересчитать соответственно и количество всех участвующих в реакции ингредиентов). Кроме испытуемых рекомендуется брать в качестве контроля 1—2 заведомо положительные сыворотки и 1—2 отрицательные. Кроме того, на каждую исследуемую сыворотку также ставится контроль.
В штативе расставляют необходимое число пробирок. В 1-й ряд разливают все исследуемые и контрольные сыворотки в разведении 1:5, во 2-й ряд — в разведении 1 : 10 и т. д. Рядом с каждой сывороткой ставят контрольную пробирку, куда наливают сыворотку в минимальном титре (1:5). Объем жидкости во всех пробирках 0,2 мл.
Во все пробирки (кроме контрольных) разливают по 0,2 мл разведенного токсоплазменного антигена, затем во все пробирки добавляют по 0,2 мл комплемента в рабочем разведении. Кроме того, ставят два контроля антигена: на антикомплементарность (0,2 мл антигена + 0,2 мл комплемента + 0,2 мл физиологического раствора) и гемотоксичность (0,2 мл антигена и 0,4 мл физиологического раствора).
После того как все ингредиенты разлиты, штатив с пробирками помещают в холодильник на 16—18 ч.
На следующий день из холодильника вынимают колбочки со взвесью- эритроцитов и гемолитической сывороткой, содержимое тщательно смешивают и полученную гемолитическую систему переносят в термостат на 30 мин. Штатив с испытуемыми сыворотками также извлекают из холодильника и оставляют при комнатной температуре. После окончания срока инкубирования гемолитическую систему разливают во все пробирки в объеме 0,4 мл. Параллельно ставят контроль системы (0,6 мл физиологического раствора + 0,4 мл гемолитической смеси). Все пробирки тщательно встряхивают и помещают в термостат на 45 мин, после чего проводят учет результата реакции. Окончательную оценку делают через 30 мин после стояния при комнатной температуре.

При учете результата реакции обращают внимание прежде всего на контроли. В пробирках с контролем к каждой сыворотке должен быть полный гемолиз, в противном случае реакция с данной сывороткой считается непрошедшей и должна быть заново повторена. Заведомо отрицательная сыворотка должна дать гемолиз, заведомо положительная — полную задержку гемолиза. В контроле антигена на антикомплементарность должен наблюдаться полный гемолиз, в контролях антигена на гемотоксичность и гемолитической системы все эритроциты должны быть в осадке.
Затем уже приступают к оценке результата реакции в исследуемых сыворотках. Степень задержки гемолиза оценивают в крестах в соответствии с инструкцией: + + + + — полная задержка гемолиза, жидкость бесцветная, эритроциты в осадке; + + +—явная задержка, жидкость розовая, эритроциты в осадке: +Н——————————————————- частичная задержка, жидкость окрашена интенсивно, осадок эритроцитов виден хорошо; + — слабая задержка, жидкость интенсивно окрашена в красный цвет, осадок незначительный, слабо заметен. Полный гемолиз обозначают знаком минуса.
Положительной реакция считается начиная с титра 1 :5 при задержке гемолиза не менее чем на два креста.

оглавление